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文献名:Mass Spectrometry-based Absolute Quantification of 20S Proteasome Status for Controlled Ex-vivo Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells(基于质谱技术的20S蛋白酶体绝对定量方法监控人体脂肪来源间充质间质干

时间:2019-04-14 23:55:17      阅读:115      评论:0      收藏:0      [点我收藏+]

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期刊名:Mol Cell Proteomics

发表时间:(2019年4月)

IF5.232

 

概述

20S蛋白酶体是一种多亚基蛋白质复合物,参与许多组织细胞生命活动过程。本研究基于SILAC标记的蛋白酶体的MRM技术,以监测人体不同组织细胞中20S蛋白酶体亚型的绝对表达量。并将这种高准确性的SILAC标记的多重LC-选择反应监测(SRM)定量质谱分析方法,应用于对不同培养条件下体外扩增脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)中的20S蛋白酶体表达量的监测,结果发现IFNγ刺激或20%常氧环境培养ADSCs使其免疫型蛋白酶体表达量上调。

 

研究背景

蛋白酶体是一种多亚基复合物,能通过蛋白质降解调控多种细胞生命活动,近年来已被确定为肿瘤学中的治疗靶标。由于缺乏一种能直接准确定量生物样品中总体蛋白酶体状态的技术方法,对蛋白酶体功能的理解和相应特定调节剂的开发而受到阻碍。本研究开发出一种针对普遍存在且具组织特异性人20S蛋白酶体亚型的绝对定量和化学计量的方法,此方法基于SILAC标记的多重LC-选择反应监测(SRM)定量质谱分析,具有高精度,高准确性和灵敏度。该方法最初通过与ELISA测定法比较,在人体组织细胞范围内,通过对HeLa细胞IFNγ刺激前后催化亚基的动力学进行优化和验证。然后成功应用于揭示脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)原代培养过程中根据IFNγ或不同O2浓度等培养条件对其蛋白酶体状态的依赖性变化。若标准蛋白酶体向免疫蛋白酶体的转变可以作为ADSCs免疫抑制和分化能力的预测指标,那么除了监测细胞质量控制的一些必需参数外,还应包括蛋白酶体定量。这种具有高准确性的绝对定量方法可作为一种新的且强有力的工具,用于在癌症或炎性疾病中进行更多个体化方案的把控。

 

 

实验设计

 技术分享图片

 

研究成果

1、人体组织细胞中至少存在六种不同形式的20S蛋白酶体。 标准20S蛋白酶体(sP20S)由亚基(α1-α7,β3,β4,β6,β7)与催化亚基(β1,β2,β5)组成,在大多数细胞类型中含量最为丰富。免疫细胞20S蛋白酶体中至少含有一个免疫型催化亚基,此催化亚基可由炎性细胞因子诱导表达。另外还具有一些组织特异性的20S蛋白酶体亚型,如胸腺蛋白酶体(β5t  P20S)与生殖细胞蛋白酶体(α4s  P20S)。为了实现对20S蛋白酶体及其亚基的精确定量,结合IDMS和SRM的工作流程,最后选用较AQUA更具准确性的SILAC标记定量方法,成功在不同来源的八种不同的人源细胞系(HEK 293T,HCT116,RKO,U937,HeLa S3,NB4,KG1a和MRC5)的蛋白质裂解物中实现了总20S蛋白酶